La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) amplifica una secuencia de DNA mediante ciclos repetidos de separación de cadenas y replicación del DNA.
Con la PCR cada DNA recién sintetizado se convierte en una molécula molde para generar más, creando así una reacción en cadena que genera copias de DNA de manera exponencial.
La PCR ha revolucionado la biología debido a su capacidad de utilizar cantidades infinitesimalmente pequeñas de DNA y amplificarlo en cantidades susceptibles de análisis utilizando a la enzima DNA polimerasa, que es la encargada de sintetizar nuevas copias de DNA.
¿Cómo funciona la PCR?
La PCR típica en realidad, amplifica solo una región o secuencia diana elegida dentro de una muestra compleja de DNA mediante dos pequeñas moléculas de DNA monocatenario llamados iniciadores (primers o cebadores) de PCR.
Los iniciadores de PCR son la clave para amplificar solo una secuencia diana definida de una muestra compleja, incluso tan compleja como una muestra de DNA aislada de suelo o agua, que puede contener millones de fragmentos diferentes de DNA de los microbios que habitan estos entornos.
Esta técnica de PCR, conocida también como PCR punto final, se puede resumir como en la imagen anterior. Primero, se extrae el DNA bicatenario que contiene la región diana y luego se calienta hasta que se vuelve monocatenaria. A continuación, los iniciadores de PCR se parean al principio y al final de la región objetivo. Finalmente, la DNA polimerasa hace copias de la región diana.
El primer paso en la PCR es mezclar los siguientes componentes o ingredientes en un tubo:
- La molécula de DNA original o el DNA diana en una pequeña cantidad es suficiente. El DNA diana puede ser parte de una muestra de DNA compleja, que contiene múltiples genomas de diferentes organismos, pero también podría ser tan simple como un fragmento de DNA previamente amplificado por PCR.
- Se necesitan dos iniciadores de PCR para comenzar la síntesis de DNA. Estos son fragmentos cortos de DNA monocatenario que son complementarios a las secuencias en cada extremo del segmento de DNA diana. Estos iniciadores se obtienen mediante síntesis química de DNA.
- Se necesita DNA polimerasa para sintetizar las copias de DNA. La PCR implica varios pasos de alta temperatura, por lo que se requiere una DNA polimerasa resistente al calor. Las polimerasas termoestables se aíslan de bacterias que viven en ambientes a temperaturas de hasta 90 ºC o más. La DNA polimerasa Taq de Thermus aquaticus es la más usada, pero muchas especies diferentes de bacterias termófilas han proporcionado características mejoradas para realizar copias de una secuencia de DNA diana durante la PCR.
- La DNA polimerasa necesita un suministro de nucleótidos, o bloques de construcción para el nuevo DNA, con el objetivo de sintetizar las nuevas copias. Estos se suministran como desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP).
- Una solución amortiguadora o tampón que contiene las concentraciones adecuadas de iones y pH que garantizan las condiciones óptimas.
El segundo paso de la PCR es colocar el tubo con los ingredientes en una máquina especial llamada máquina de PCR o termociclador, que es capaz de alternar la temperatura del tubo de reacción de PCR de forma rápida y precisa.
El termociclador alterna la temperatura desde un máximo de 95 °C hasta un mínimo de 4 °C. Normalmente, una reacción de PCR se realizará en 20-40 ciclos con tres temperaturas diferentes en cada uno de los ciclos. Cada ciclo consta de una temperatura de desnaturalización, una temperatura de alineamiento y finalmente una temperatura de extensión.
De todos los avances técnicos en biología molecular moderna, la PCR es uno de los más útiles; de hecho, la PCR es lo suficientemente sensible como para amplificar el DNA de una sola célula.
Aplicaciones de PCR punto final
No es sorprendente que la PCR haya encontrado aplicaciones en todos los campos de la biología molecular y la biotecnología, tanto básica como aplicada. Estos incluyen análisis y manipulación de DNA, construcción de plantas y animales transgénicos, ciencia forense, diagnóstico médico, terapia génica y análisis ambiental.
En teoría, la PCR amplifica el DNA de manera exponencial, duplicando el número de moléculas diana con cada ciclo de amplificación. Cuando se desarrolló por primera vez, los científicos razonaron que el número de ciclos y la cantidad de producto final de la PCR podrían usarse para calcular la cantidad inicial de material genético en comparación con un estándar conocido. Para abordar la necesidad de una cuantificación sólida, se desarrolló la técnica de PCR en tiempo real.
Actualmente, una aplicación principal de la PCR de punto final es amplificar DNA específico para secuenciar, clonar y usar en distintas técnicas de biología molecular.