La PCR en tiempo real es una variación de la técnica de PCR estándar que se usa comúnmente para cuantificar DNA o ARN en una muestra. En la PCR punto final, la detección y la cuantificación de la secuencia amplificada se realizan al final de la reacción después del último ciclo de PCR, e implican un análisis posterior a la PCR, como electroforesis en gel y análisis de imágenes.
En la PCR cuantitativa o en tiempo real, a menudo abreviada a PCR en tiempo real o qPCR, el producto de la PCR se mide en cada ciclo. Al monitorear las reacciones durante la fase de amplificación exponencial de la reacción, los usuarios pueden determinar la cantidad inicial del objetivo con precisión alta.
¿Cómo funciona la PCR en tiempo real?
En la PCR en tiempo real, la cantidad de DNA se mide después de cada ciclo a través de señal fluorescente creciente en proporción directa al número de moléculas de producto de PCR.
Los datos recopilados durante la fase exponencial de la reacción proporcionan información cuantitativa sobre la cantidad inicial del objetivo de amplificación. Si una secuencia particular (DNA o ARN) es abundante en la muestra, se observa amplificación en ciclos anteriores; si la secuencia es escasa, se observa amplificación en ciclos posteriores.
Los indicadores fluorescentes utilizados en la PCR en tiempo real incluyen colorantes de unión al DNA bicatenario (dsDNA) o moléculas de colorante unidas a iniciadores o sondas de PCR que se hibridan con productos de PCR durante la amplificación.
El cambio de fluorescencia en el transcurso de la reacción se mide con un instrumento que combina ciclos térmicos con barrido de tintes fluorescentes. Al representar la fluorescencia frente al número de ciclo, el instrumento de PCR en tiempo real genera una gráfica de amplificación que representa la acumulación de producto durante toda la serie de PCR.
Los gráficos de amplificación se crean cuando la señal fluorescente de cada muestra se representa frente al número de ciclo; por lo tanto, las gráficas de amplificación representan la acumulación de producto durante la duración del experimento de PCR en tiempo real.
Las ventajas de la PCR en tiempo real incluyen:
- Capacidad para monitorear el progreso de los ciclos individuales de amplificación, a medida que ocurren en tiempo real.
- Capacidad para medir con precisión la cantidad de amplicón en cada ciclo, en comparación con un estándar de dilución conocido, lo que permite una cuantificación altamente precisa de la cantidad de material de partida en las muestras.
- Un mayor rango dinámico de detección.
- La amplificación y la detección se realizan en un solo tubo, lo que elimina las manipulaciones posteriores a la PCR.
Etapas en la PCR en tiempo real
Hay tres pasos principales que componen cada ciclo en la PCR en tiempo real.
1. Desnaturalización
La incubación a alta temperatura se utiliza para “separar” dsDNA en hebras simples y aflojar la estructura secundaria en el DNA monocatenario (ssDNA). La temperatura más alta que puede soportar la DNA polimerasa sin perder fidelidad suele ser de alrededor de 95 °C.
2. Alineamiento (hibridación)
Durante el alineamiento, las secuencias complementarias tienen la oportunidad de hibridar, por lo que se usa una temperatura apropiada basada en la temperatura de fusión (Tm) del iniciador.
3. Extensión
La actividad de la DNA polimerasa es óptima a 70-72 °C, y la extensión del iniciador se produce a velocidades de hasta 100 bases por segundo. Cuando un amplicón es pequeño, este paso a menudo se combina con el paso de alineamiento, aplicando una temperatura de 60 °C.
PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR)
La RT-qPCR se usa cuando el material de partida es RNA. En este método, el RNA se transcribe primero en DNA complementario (DNAc) por transcriptasa inversa del RNA total o mensajero (RNAm).
El cDNA se usa como molde para la reacción de qPCR. Los componentes de reacción de la PCR en tiempo real son: DNA polimerasa, La transcriptasa inversa, dNTP y magnesio. RT-qPCR se utiliza en una variedad de aplicaciones que incluyen análisis de expresión génica, validación de ARNi, validación de microarrays, detección de patógenos, pruebas genéticas e investigación de enfermedades.
RT-qPCR de dos pasos
La RT-qPCR de dos pasos comienza con la transcripción inversa de RNA total o poli (A) en DNAc utilizando una transcriptasa inversa. Esta reacción de síntesis de DNAc de primera hebra se puede lograr usando indicadores aleatorios, oligo (dT) o iniciadores específicos de genes.
RT-qPCR de un paso
RT-qPCR de un solo paso combina la reacción de síntesis de cDNA de la primera hebra y la PCR en tiempo real en el mismo tubo, lo que simplifica la configuración de la reacción y reduce la posibilidad de contaminación. Se requieren iniciadores específicos de genes porque el uso de oligo (dT) o iniciadores aleatorios generaría productos no específicos en el procedimiento de un solo paso y reduciría la cantidad de producto de interés.
Químicas fluorescentes de PCR en tiempo real
Existen muchas químicas fluorescentes de PCR en tiempo real. Sin embargo, las más utilizadas son los ensayos de nucleasa 5ʹ (como los ensayos TaqMan basados en sondas) y los ensayos basados en colorantes SYBR Green.
El ensayo de nucleasa 5ʹ recibe su nombre de la actividad nucleasa 5’ asociada con la DNA polimerasa Taq
El dominio de nucleasa 5ʹ tiene la capacidad de degradar el DNA unido al templado, downstream de la síntesis de ADN. Un segundo elemento clave en el ensayo de nucleasa 5ʹ es un fenómeno llamado transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).
En FRET, las emisiones de una señal fluorescente pueden reducirse considerablemente por la presencia de otra señal, a menudo llamado apagador (quencher), en las proximidades. La señal extintora se encuentra en el extremo 3′, mientras que el ´reportador está en el extremo 5′ de la sonda Taqman.
FRET ocurre cuando una señal fluorescente de emisión de luz más alta (azul) está muy cerca de una señal fluorescente de emisión de luz más baja (rojo) (izquierda). FRET no ocurre cuando las dos señales fluorescentes no están muy cerca (derecha).
Un ensayo de nucleasa 5ʹ para la detección o cuantificación de un objetivo generalmente consta de dos iniciadores de PCR y una sonda TaqMan.
Antes de que comience la PCR, la sonda TaqMan está intacta y tiene cierto grado de flexibilidad. En este estado, el reportador y el apagador tienen una afinidad natural entre sí, lo que permite que ocurra FRET. La señal reportadora es apagada antes de la PCR.
Durante la PCR, los iniciadores y la sonda se aparean con el objetivo. La DNA polimerasa extiende el iniciador upstream de la sonda. Si la sonda está unida a la secuencia diana correcta, la actividad nucleasa 5’ de la polimerasa escinde la sonda, liberando un fragmento que contiene la señal reportador. Una vez que tiene lugar la escisión, las señales reportador y apagador ya no se atraen entre sí; la molécula reportadora liberada ya no se apagará.
La sonda TaqMan tiene una secuencia específica de gen y está diseñada para unirse entre los dos iniciadores de PCR. Adjunto al extremo 5’ de la sonda TaqMan está el “reportador”, que es una señal fluorescente que informará la amplificación del objetivo.
En el extremo 3 de la sonda hay un apagador (quencher), que apaga la fluorescencia del indicador en sondas intactas. El apagador también bloquea el extremo 3’ de la sonda para que no pueda ser extendido por la DNA polimerasa termoestable.
Colorante SYBR Green
El colorante SYBR Green I es un colorante fluorescente que se une a cualquier DNA bicatenario. La excitación del colorante SYBR Green unido al DNA produce una señal fluorescente mucho más fuerte que el colorante libre. Generalmente, un ensayo basado en colorante SYBR Green consta de dos iniciadores de PCR.
En condiciones ideales, un ensayo SYBR Green sigue un patrón de amplificación similar al de un ensayo basado en sonda TaqMan. En los primeros ciclos de PCR, se observa una línea de base horizontal. Si el objetivo está presente en la muestra, el producto de PCR se acumula y producirá una señal fluorescente.